Birch ha discusso i requisiti per sistemi efficienti di trasformazione. Fondamentalmente, il protocollo di traformazione deve essere indipendente dalla varietà, tecnicamente semplice e sicuro da attuare. Il tessuto bersaglio deve essere rigenerabile, disponibile subitamente e il tempo richiesto per la coltivazione dovrebbe essere minimo per ridurre sia i costi che la variazione soma clonale. Idealmente, le procedure di selezione devono essere efficienti, produrre trasformanti stabili con semplici modelli di integrazione di DNA estraneo a basso numero di copie senza l’incorporazione di sequenze di vettori non richiesti dal T-DNA esterno, o incontrare l’espressione del transgene variabile, a causa della posizione dell’inserimento del transgene o della cosoppressione del transgene a copia multipla indotta.
La produzione di trasformanti uniformi con cotrasformazione efficiente e un’integrazione stabile di geni multipli è essenziale. Inoltre, la possibilità di rimuovere i geni reporter e di marcatori selezionabili dalle piante trasformate è desiderabile e potrebbe diventare obbligatorio in futuro. Varie procedure sperimentali sono disponibili per introdurre i geni nelle piante bersaglio, con ogni approccio avente i suoi propri pro e contro. Queste metodologie che sono state estensivamente valutate per il riso e il mais, includono la comprensione del DNA nei protoplasti isolati, l’uso della biolistica, l’elettroporazione, elettroforesi e agitatori di moissanite e , più recentemente, l’invio del gene tramite l’Agrobacterium.
Tecnologie basate sui protoplasti
Durante la fine degli anni ’80 e gli inizio ’90, si pose enfasi sull’uso dei protoplasti isolati dalle sospensioni della cellula embriogenica dei cereali come recipienti per il DNA estraneo. Tali procedure sono state riviste da Maas. In generale, il callo embriogenico promosso dai tessuti, come gli embrione dello zigote immaturo, è trasferito a un mezzo liquido per la produzione di sospensioni di cellula omogenee e a crescita rapida contenenti un’alta proporzione di cellule densamente citoplasmatiche, e a divisioni attiva. La digestione enzimatica delle pareti di tali cellule rilascia popolazioni di protoplasti (cellule nude), che sono miste al DNA esterno. I protoplasti comprendono questo DNA attraverso la loro membrana plasmatica quando trattato con prodotti chimici come il glicole polietilenico e/o le vibrazioni elettriche ad alto voltaggio. Varie difficoltà sono associate a questa tecnica. Sebbene circa il 50% dei protoplasti comprende il DNA esogeno, la frequenza della trasformazione finale è bassa, ed ha come scopo solitamente un protoplasta su 105 che vengono stabilmente trasformati. Inoltre, lo sviluppo di questa tecnologia si affida ai sistemi efficienti di rigenerazione dei protoplasti nella pianta, che sono spesso dipendenti dal genotipo. La produzione di sospensioni delle cellule che rilasciano protoplasti totipotenti è , in teoria, semplice. Comunque, in pratica, è faticoso, richiede spreco di tempo, e si affida pesantemente all’intuizione del lavoratore per identificare e selezionare ad uno stadio iniziale quelle cellule che sono più probabile che producano le sospensioni delle cellule adatti all’isolamento dei protoplasti. Inoltre, piante aberranti sono spesso rigenerate dai tessuti derivati dai protoplasti trasformati, frequentemente con copie multiple di DNA estraneo associato a modelli complessi di integrazione nel genoma della pianta.
Nonostante queste limitazioni, la trasformazione dei protoplasti ha reso possibile la produzione del primo riso e delle prima piante di mais transgeniche. Sfortunatamente, le piante transgeniche modificate in questi primi esperimenti erano sterili. Di conseguenza, comunque, Golokin, ha introdotto un gene mutante di dihydrofolate reductase (DHFR) dal topo che conferisce resistenza al methotrexate nei protoplasti del mais usando PEG e piante fertili generate, con esperimenti di impollinazione incrociata che permette le analisi di segregazione del transgene nelle generazioni del seme. In modo interessante, recenti studi hanno reso evidente che la trasformazione del protoplasto può essere usata nel mais per generare trasformanti con inserimenti di DNA estraneo a singola copia e ben definiti. Gli ultimi autori hanno introdotto i geni vieD1, virD2 e virE2 dal plasmide Ti dell’Agrobacterium tumefaciens nei protoplasti su un plasmide, che portava i geni di interesse fiancheggiati dalle sequenze di ripetizione del T-DNA dell’Agrobacterium 25bp. Anche questi ultimi venivano dal plasmide Ti. La prensenza del gene virE2 dava il massimo della trasformazione. Senza dubbio, tali esperimenti erano stimolati da sviluppi recenti nella trasformazione tramite Agrobacterium dei cereali e dalla accresciuta conoscenza della biologia molecolare delle interazioni della pianta-agrobacterium, specialmente la rilevanza dei geni di virulenza(vir) nel trasferimento del t-Dna. In altri esperimenti, Tsugawa ha riportato l’uso del polimero sintetico dell’amino policazionico (policazione) per la trasformazione del protoplasto del riso, ma questo sistema richiede ulteriore verifica. Armstrong presenta una larga revisione della trasformazione del mais tramite l’uso dei protoplasti. Allo stesso modo, Tyagi ha sintetizzato il recente progresso dal 1997 nella trasformazione del riso tramite protoplasti per la produzione di piante resistenti a insetti, funghi e erbicidi. È probabile che possa esserci un risorgere di interesse nella comprensione del DNA nei protoplasti isolati per la trasformazione di riso e mais in vista delle più recenti conquiste.
Biolistica
La biolistica, coniata dal termine “balistica biologica”, è anche conosciuta come bombardamento a microproiettili, accelerazione delle particelle, bombardamento delle particelle o cannone genico. Esso implica l’invio di particelle di tungsteno o oro (solitamente oro perché è inerte chimicamente) di una misura adatta,rivestite di Dna, nelle cellule della pianta. Dai primi risultati di questa tecnologia sono state apportati miglioramenti alla strumentazione per sfruttare la scarica elettrica o la pressione dell’elio per un’accelerazione delle particelle più controllata e consistente. Il mais fertile transgenico fu generato per la prima volta da Gordon-kamm seguendo il bombardamento a microproiettili delle sospensioni delle cellule embriogeniche, mentre Christou inizialmente applicò questa procedura al riso per introdurre il Dna negli embrioni immaturi delle varietà indica e japonica. Al momento, questa tecnologia è di routine per la trasformazione dei cereali in vari laboratori in tutto il mondo, usando cellule toti-potenti come bersagli della trasformazione. Come nel caso della trasformazione tramite protoplasti, il materiale che riporta il riso e il mais stabilmente trasformati è stato rivisto da Tyagi e Armstrong rispettivamente. I vantaggi del bombardamento a microproiettile sono che non c’è nessun prerequisito per lo sviluppo di sistemi di protoplasti da impiantare con varietà specifica, e bypassa qualsiasi specificità ospite associata all’invio del gene tramite Agrobacterium. Il sistema è indipendente sia dalla varietà che dalle specie, facile da applicare e i transgeni possono essere introdotti in qualsiasi tessuto di qualsiasi genotipo di pianta. La disponibilità commerciale della strumentazione biolistica, come l’apparecchio BioRad PDS 100/He, ha facilitato la standardizzazione dei parametri di invio del gene in vari laboratori sebbene altri apparecchi, come il cannone di immissione di particelle o gli strumenti costruiti su ordinazione, sono stati usati per l’invio di geni nel riso, mais e altri cereali. Pareddy ha discusso vari aspetti della trasformazione del mais attraverso il bombardamento a microproiettile usando l’esplosione a elio e ha descritto il principio e il modello di due nuove apparecchiature per un rapido invio di DNA e/o con lo scopo rendere possibile la produzione di mais transgenico. È degno di nota il fatto che Sudhakar ha descritto l’uso di uno strumento di bombardamento di particelle a elio portatile, non costoso, che rappresenta un miglioramento del concetto di immissione di particelle e che opera senza alcun mezzo. Tale strumento, che dà stime di trasformazioni comparabili a quelle di altri strumenti più sofisticati, dovrebbe facilitare il trasferimento e lo sviluppo di questa tecnologia ai laboratori che, attualmente, sono stati incapaci di acquistare strumentazioni più costose. Inoltre, potrebbe facilitare l’invio del gene alle piante cresciute nei campi. Caratteristiche importanti legate all’ottimizzazione della trasformazione tramite bi olistici includono la natura dei microproiettili, l’uso del cloruro di calcio e spermidine per favorire l’adesione del DNA ai microproiettili, la scelta di costrutti di DNA e di espianti bersaglio, insieme ai parametri di bombardamento fisico. Quest’ultimo include la distanza di volo delle particelle nello strumento, la pressione dell’elio e le condizioni del mezzo. Le condizioni delle cellule bersaglio sono cruciali nel massimizzare la trasformazione. Per esempio, nel caso degli embrioni zigotici immaturi, le condizioni di crescita della pianta donatrice devono essere ottimali, evitare l’esposizione a condizioni di stress come insetti infestanti o attacco da parte di malattie, o rifornimento d’acqua, temperature e umidità sub-ottimali. Le condizioni scarse di crescita della pianta donatrice colpiscono la fisiologia all’esterno della pianta e la competenza delle cellule per la trasformazione. I parametri fisici e le condizioni che influenzano il bombardamento a microproiettili sono descritti da Christoul e Southgate . Chen ha riportato il loro protocollo per la produzione consistente a su larga scala di piante di riso transgeniche usando la biolistica, mentre Hagio ha fornito suggerimenti per accrescere e massimizzare l’efficienza di trasformazione usando questa tecnica di invio del gene.
Trasformazione tramite Agrobacterium
La biologia molecolare della trasformazione tramite Agrobacterium dei dicotiledoni è ora relativamente ben compresa insieme alla possibile modalità di inserimento di DNA trasferito dal plasmide Ti o Ri nel genoma della pianta recipiente. Una caratteristica essenziale del processo è che i geni virD1 e virD2 del plasmide Ti o Ri codificano endonucleasi specifici per finali definiti del T-Dna, che assicura il trasferimento controllato del Dna con un minimo riarrangiamento sull’ingresso nel genoma della pianta recipiente. Il Dna estraneo inserito tra i limiti del T-Dna è introdotto nelle cellule della pianta recipiente. L’invio del gene nei dicotiledoni tramite l’Agrobacterium tumefaciens, e a un minore estensione tramite A. rhizogeni, è stato sfruttato molto per vari anni con i T-Dna, disarmati dalla rimozione dei loro geni di oncogenicità, essendo usati per rendere effettivo l’invio del gene. Tali Dna disarmati sono trattenuti sia sul plasmide Ti che rimossi dal plasmide Ti e inseriti in un plasmide più piccolo. Il plasmide Ti, mentre privato del suo T-dna, trattiene ancora i suoi geni Vir per effettuare il trasferimento del T-Dna dal plasmide più piccolo alle cellule della pianta recipiente. Tali Agrobatteri pertanto portano due plasmidi, che costituiscono il sistema vettore binario. L’invio del gene tramite l’Agrobacterium è semplice, efficiente quando ottimizzato, e trasferisce un basso numero di copie di transgeni intatti. Comunque, la procedura è stata più difficile da applicare ai cereali e altri monocotiledoni, dato che non sono infettati naturalmente dall’Agrobacterium. Sebbene le procedure basate sull’Agrobacterium sono state valutate in vari laboratori per un certo numero di anni, con i primi risultati di trasferimento di T-Dna nel mais e riso, questi primi esperimenti della trasformazione tramite Agrobacterium dei monocotiledoni erano visti con scetticismo. In una pubblicazione miliare, Hiei ha fornito l’evidenza inequivocabile circa la produzione di piante di varietà di riso japonica esprimenti Gus resistenti all’Hygromicin, che stimolava lo sviluppo dei sistemi di trasformazione tramite Agrobacterium per altri cereali, come il mais. Senza dubbio, vari fattori influenzano l’efficienza della trasformazione tramite Agrobacterium del riso e del mais. Di preciso, l’uso di cellule che si dividono in modo attivo come quelle del callus derivato dallo scutellum embriogenetico, l’esposizione delle cellule batteriche alla molecola di segnale di ferita fenolica, l’acetosiringone, per attivare l’espressione del gene dell’Agrobacterium vir, l’uso di generazioni di Agrobatterio supervirulente e lo sviluppo dei vettori superbinari, combinati con un appropriato marcatore selezionabile. Nel loro report, Hiei ha valutato una gamma di espianti per la trasformazione, insieme con le generazioni di Agrobacterium comunemente usate per trasformare i dicotiledoni, chiamate LBA4404 e la supervirulenta EHA101. La trasformazione era più efficiente con il callus embriogenetico derivato dallo scutellum (in comune con le osservazioni generali della biolistica) del riso japonica Koshihikari. Sia EHA101, che porta il vettore binario pIG121Hm, che LBA4404, con il vettore pTOK233, trasformavano le cellule del riso. LBA4404 conteneva, sul vettore binario, i geni virB e virG dal plasmide Ti Bo542 dell’A. tumefaciens, che risultava in un plasmide superbinario. Questa combinazione generazione/vettore era superiore alle altre generazioni valutate, dovuto all’accresciuta virulenza risultante dall’amplificata espressione dei geni vir. Fino al 28,6% dei tessuti derivati dallo scutellum immunizzati con LBA4404 producevano piante transgeniche. Di conseguenza, altri lavoratori hanno riportato la trasformazione riproducibile tramite Agrobacterium delle varietà indica di riso Basmati 385 e Basmati 370 da parte dell’EHA101(pIG121Hm), la varietà di riso japonica Radon e le varietà di indica IR72 e TCS10 da parte di LBA4404 (pTOK233) e le varietà di javanica commercialmente importanti Gulfmont e Jefferson con gli stessi costrutti e generazioni sviluppate da Hiei. Zhang anche ha usato il LBA4404 per generare piante transgeniche fertili della varietà di indica Pusa Basmati 1, mentre Azhakanandam ha confermato l’efficienza dello stesso costrutto per trasformare le varietà sottospecie di japonica, indica e javanica del riso. Tutti questi risultati hanno confermato l’integrazione del transgene nel genoma delle piante recipienti, generalmente a un basso numero di copie, sebbene singole copie di inserimenti di T-Dna erano rare. L’analisi della sequenza ha rivelato che i limiti del T-Dna nel riso transgenico erano essenzialmente uguali a quelli nei dicotiledoni trasformati tramite l’Agrobacterium. La trasmissione dei transgeni tramite le generazioni del seme era mendeliana, come confermato da altri report. Questi risultati collettivamente confermano l’appropriatezza di questo approccio per lo sviluppo biotecnologico del riso. È importante sapere che, la trasformazione tramite Agrobacterium è stata estesa ad altri cereali, con il primo risultato di trasformazione di mais da parte di Ishida, usando gli embrioni immaturi come tessuto bersaglio. Un interessante concetto è quello di Trick e Finer, che hanno mostrato che esporre i tessuti a brevi periodi di ultrasuoni in presenza dell’Agrobacterium risulta in un aumento di 100 fino a 1400 dell’espressione del transgene nel tessuto di varie piante del raccolto, incluso il mais. Apparentemente, gli ultrasuoni producono piccole e uniformi fessure e canali tra le cellule della pianta, facilitando l’accesso dell’Agrobacterium all’interno dei tessuti della pianta. Un approccio simile è stato riportato da Zhang, con il risultato della produzione di piante di mais fertile trasformate con un gene della proteina insetticida §(Bt) dal Bacillus Thuringienis: in questa procedura sono importanti i parametri di intensità acustica e durata del trattamento. Recenti sviluppi nella trasformazione della cellula tramite Agrobacterium, inclusa la produzione e l’analisi di varie generazioni e vettori dell’Agrobacterium, sono discussi da Tyagi, Hiei, e Komari, e gli enzimi pectolitici, o tramite ferita, ci sono affermazioni circa il fatto che l’elettroporazione (elettropulsazione) con scariche elettriche ad alto voltaggio possa inviare il DNA a cellule e tessuti intatti. Nel mais, questo approccio è stato sfruttato per introdurre il gene gus e i geni per il Chloramphenicol Acetyl Transferase (cat) e il phosphinothricin Acetyl Transferase (bar) nelle cellule intatte del mais dolce nero messicano, con la plasmolisi della cellula prima dell’elettropulsazione essenziale nel processo di trasformazione. Altri lavoratori hanno anche trasferito i geni negli embrioni immaturi e nel callo di tipo 2 ( embriogenico) della generazione di mais A188. il risultato di questi ultimi autori erano comparabili a quelli di Pescitelli e Sukhapinda per l’espressione del transgene gus nel callo di tipo 2 dei genotipi ibrido highII e il back-crossed B73. Comunque, in contrasto con il report di D’Halluin, il trattamento dell’enzima dei tessuti del mais non era richiesto per facilitare l’ingresso del Dna nelle cellule recipienti. L’immersione di cellule bersaglio nel buffer di elettroporazione potrebbe essere sufficiente per permettere la diffusione del Dna attraverso la parete cellulare nella prontezza per il suo passaggio attraverso la membrana plasmatica durante l’elettroporazione. Il successo è stato anche riportato nelle trasformazione delle rare varietà di riso italiano Lido, Cornaroli e Thaibonnet attraverso l’elettroporazione delle cellule di sospensione cresciute, portando all’esibizione della pianta transgenica di cambiamenti genomici trascurabili. L’elettroforesi del tessuto è stata valutata per l’invio di Dna nei cereali, credendo che il Dna migri verso i tessuti bersaglio quando questi ultimi sono esposti a campo elettrico a basso voltaggio per varie ore. Sebbene ci siano resoconti dell’utilizzo di questa procedura per introdurre il Dna negli embrioni del mais, Southgate fu incapace di ottenere l’evidenza dell’introduzione del gene nei tessuti embriogenici del mais. Il trasferimento del gene tramite raggi al riso è stato allo stesso modo descritto. Soprattutto, mentre le tecniche come la microiniezione, l’uso di agitatori di moissenite, l’elettroforesi del tessuto e i raggi laser sono disponibili, essi probabilmente continueranno ad avere un’applicazione limitata per la trasformazione dei cereali.
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